Cell重磅:黃超蘭課題組與合作者利用新型絕對定量質譜法揭示CD3ε 的多重信號轉導功能

2020729日,北京大學醫學部黃超蘭團隊,中科院上海生化與細胞所許琛琦團隊、美國加州大學圣地亞哥分校惠恩夫團隊,聯手在國際知名學術期刊Cell上發表了題為“Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy”的論文,該研究通過開發基于質譜的絕對定量蛋白質組新方法,揭示了T細胞受體-共受體TCR-CD3)復合物酪氨酸在不同抗原刺激下的動態磷酸化修飾全貌,解析了不同CD3ITAM結構域磷酸化特征的奧秘,從中發現了其中一條亞基CD3ε的單磷酸化新功能,有望助力于設計全新的CAR-T療法。

TCR-CD3復合物在T細胞的發育、激活及對病原的免疫反應中起著決定性作用。這一重要作用來自于CD3鏈胞內端的免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif-ITAM)及其磷酸化狀況。深入探索 CD3 ITAM的酪氨酸動態磷酸化模式可為全面理解不同CD3鏈的功能提供核心信息及其在構建CAR-T細胞療法的意義。 為了精確繪制出TCR-CD3受體復合物10個ITAM上的20個磷酸化位點的修飾動態過程,黃超蘭團隊開發了一種新穎的絕對定量方法Targeted-IP-Multiplex-Light-Absolute-Quantitative Mass SpectrometryTIMLAQ-MS)。區別于目前報道的蛋白組絕對定量手段,此方法不需要加入同位素重標的合成肽段,而是巧妙地利用串聯質量標簽(TMT),設計將6個標準樣品和4個分析樣品混合起來;用數據依賴采集(Data-dependent acquisition, DDA)結合平行反應監測(Parallel reaction monitoring, PRM)的方式獲得抗原刺激下,TCR-CD3免疫沉淀(IP)復合物中不同酪氨酸位點的磷酸化/非磷酸化在不同時間點的定量結果。TIMLAQ 成功繞過了以前的定量方法中通常使用的同位素重標記肽,既節約了成本,又有效降低了方法的復雜性和數據采集誤差,進一步提高了定量準確性,最終可完全實現在一次測量中對不同時間點全部ITAM磷酸化修飾的絕對定量,描繪TCR-CD3復合物的酪氨酸動態磷酸化修飾全貌。

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基于TIMLAQ-MS法的CD3 ITAM磷酸化修飾鑒定

利用這一方法鑒定到在不同的TCR刺激條件下,CD3各亞基主要表現為雙磷酸化修飾模式,而唯獨CD3ε則呈現出單磷酸化修飾模式。這一特殊的新發現驅使作者進一步深入探索CD3εTCR通路中的新潛在功能。結果顯示,單磷酸化的CD3ε可通過專門募集抑制性Csk激酶減弱TCR信號傳導,說明TCR中既有激活基元又有抑制基元,總體呈現為一種自制的信號傳導機制。作者團隊進一步深入研究,發現一旦將CD3ε細胞質結構域整合到第二代CAR中,CD3εITAM結構域可以通過募集Csk減少CAR-T細胞因子的產生,而CD3εBRS結構域則可以通過募集p85促進CAR-T細胞的持久性。 總體而言,將CD3ε應用于CAR的設計可顯著提高CAR-T細胞的抗腫瘤活性。

? ? ?從一個重要的基礎生物學問題開始,為解決問題而開發一個新穎方法,得到新發現,再深入探索生物學功能,最后有望貢獻在治療方法上。黃超蘭教授,許琛琦教授和惠恩夫教授作為本文的共同通訊作者,完美地演繹了不同交叉領域共同合作而產生的精彩結果。

原文鏈接:https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S0092-8674%2820%2930883-7


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作者簡介:

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? ? ? 黃超蘭教授是北京大學醫學部精準醫療多組學研究中心主任,北京大學醫學部基礎醫學院長聘副教授,北大-清華生命科學聯合中心研究員,曼徹斯特大學榮譽教授。黃教授長期致力于質譜技術開發及蛋白質組學在基礎和臨床科研中的方法學研究。首次鑒定了體內精氨酸化修飾底物并揭示其生物學功能,開啟了整個精氨酸化的研究領域。此外,黃教授與浙江大學方群教授合作在單細胞蛋白組學分析研究中取得突破性進展,迄今為止,在單一體細胞中鑒定的蛋白數量是全球領域最高水平。目前已累計發表SCI論文80余篇,包括Science, Nature, PNAS等。

(北京大學醫學部精準醫療多組學研究中心)



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